口腔外科文章--bcl-2、bax基因与程序化细胞死亡在颞下颌关节发育中的作用
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【摘要】 目的 探讨程序化细胞死亡（programmed cell death，pcd）及bcl-2、bax基因在颞下颌关节发育中的作用。方法 利用缺口末端转移酶标记法（tdt-mediated dutp nick end labeling, tunel法）、原位杂交检测mrna技术及免疫组织化学染色分别对sd胎鼠及生后1周颞下颌关节发育不同时期pcd、bcl-2 mrna及bcl-2、bax蛋白的表达进行了观察。结果 各时期髁突软骨细胞中均有pcd出现，阳性pcd细胞主要分布于软骨增殖层及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域；髁突软骨增殖层及浅肥厚层大部分细胞bcl-2 mrna表达阳性，深层肥厚层仅有极少数成熟软骨细胞bcl-2 mrna表达阳性；bcl-2蛋白表达的分布与bcl-2 mrna基因的表达部位基本一致，进入深层肥厚层减弱、消失；bax则在髁突软骨全层均有明显表达。结论 髁突软骨细胞pcd主要是受内在bcl-2及bax基因控制，pcd的部位及数量取决于bcl-2及bax表达量的变化。bcl-2可能是维持软骨细胞生命，保证软骨细胞增殖、分化和成熟的重要基因之一。
颞下颌关节（temporomandibular joint，tmj）发育的研究表明，髁突软骨是下颌骨的主要生长区，在tmj发育的早期，髁突主要由软骨细胞组成，此期的髁突软骨层具有类似于长骨生长板独立生长的特性，其生长主要受内在基因的控制［1］。我们通过观察tmj发育中髁突软骨的pcd及其与bcl-2、bax基因表达的关系，探讨了pcd及bcl-2、bax基因在tmj发育中的内在调控作用。
材料和方法
1.动物模型及标本制备：选用纯系、3个月龄sd大鼠（上海bk公司提供）20只，雌雄4∶1同笼，每日8∶00观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为妊娠0 d，分别于妊娠13、14、15、16、17、18、19、20 d脱颈处死大鼠，切取胎鼠tmj置于4%多聚甲醛中固定，另取出生后1、2、3、4、5、6、7 d幼鼠各3只，均取其tmj部置入含盐酸、甲酸及冰醋酸的4%多聚甲醛液中 固定、脱钙，流水冲洗后，常规脱水，石蜡包埋。作tmj连续矢状切片，厚度约5 μm，切片前载玻片预先严格清洁处理并涂apes胶。
2． tunel法标记pcd细胞：切片常规脱蜡放置水中，室温下20 mg/l的蛋白酶k消化15 min；3%h2o2 pbs溶液中处理5 min后，加50 μl的平衡液（tunel试剂盒原配，美国oncor公司）1 min；再加含tdt酶反应液15 μl，37 ℃反应1.5 h后用预热的中止反应液中止反应；buffer1漂洗2次（15 min/次）后加2%的正常羊血清孵育30 min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2 h；buffer 1 、buffer 3漂洗后，加新配制的显色液 (nbt/bcip显色系统，用buffer3配制，nbt4.5 μl、bcip3.5 μl、左旋咪唑0.24 g/l) 20 μl，暗处显色；中止显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
3．原位杂交检测bcl-2基因的表达：
（1） 探针及标记：质粒pdor-sb8.4（第四军医大学生化教研室朱峰博士惠赠）含1.9 kb的bcl-2基因片段。取已鉴定的质粒dna，经ecori酶切后，将目的基因用冻溶法回收。bcl-2探针参照地高辛标记检测试剂盒（boehringer mannheim公司）说明书，采用随机引物法标记。
（2）bcl-2 mrna原位杂交：①石蜡切片脱蜡后置于depc水中，分别用0.2 mol/l盐酸和20 mg/l的蛋白酶k处理，梯度酒精脱水后室温干燥；②用地高辛标记探针于42 ℃杂交后，分别用2×ssc、1×ssc、0.5×ssc、buffer1、buffer2依次充分洗涤；③2%正常羊血清封闭30 min，以下步骤与tunel染色相同。
4．免疫组织化学检测bcl-2及bax的蛋白表达：石蜡切片脱蜡至水，经3%h2o2封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10 min后，羊血清封闭30 min；加bcl-2及bax蛋白的单克隆抗体（美国santa cruz 公司）置于4℃24 h，室温下复温1 h后滴加生物素化羊抗鼠二抗 37 ℃反应30 min；再加abc复合物37 ℃孵育30 min，dab显色后，二甲苯透明、封片。本新闻共3页,当前在第1页123
责任编辑：姚红祥
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